Il paziente deve presentarsi a digiuno e senza aver fumato dalla sera precedente, non deve avere mangiato farinacei, frutta, verdura, legumi e latticini (sono consentiti prosciutto, uova, pesce e carne non conservata), inoltre non deve avere assunto antibiotici, fermenti lattici, estratti pancreatici e lassativi nei 10 giorni precedenti ed avere praticato clisteri evacuativi nei 2 giorni precedenti.

Il paziente deve eseguire degli sciacqui del cavo orale con Clorexidina 0,2% colluttorio.

Il prelievo deve essere eseguito ogni 20 minuti per 4 ore.

Importanti sono le modalità di prelievo perché vi possono essere differenze tra una mammella e l’altra e, nella stessa mammella durante il corso della poppata, essendo il primo latte più concentrato e più ricco di proteine e di grassi e l’ultimo più diluito e più povero. 

Il prelievo va fatto mediante tiralatte, e devono essere raccolti almeno 15 ml di latte.
Per quanto detto all’inizio la raccolta va fatta da entrambe le mammelle, in parte all’inizio della poppata, in parte a metà e in parte alla fine.

Si raccomanda di effettuare il test in condizioni di riposo e possibilmente a DIGIUNO da almeno sei ore. 
L’esecuzione del test richiede approssimativamente 40 minuti; il paziente dopo aver raccolto il primo campione di espirato nell’apposita provetta, assume una soluzione di UREA 13C diluita in 200 ml di acqua. 
Dopo mezzora da tale assunzione viene raccolto un secondo campione di espirato.

Poiché gli antiacidi possono interferire con la crescita dell’Helicobacter pylori si raccomanda la loro sospensione per almeno 15 giorni prima dell’esecuzione del test.
Non assumere antibiotici o farmaci contenenti omeprazolo, lansoprazolo, pantoprazolo da almeno quattro settimane prima del test. L’eventuale assunzione di ranitidina va sospesa almeno una settimana prima del test.